В момента Javascript е деактивиран във вашия браузър.Когато javascript е деактивиран, някои функции на този уебсайт няма да работят.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * Тези автори имат известна представа за тази работа Equal предистория на приноса: Хиалуроновата киселина (HA) е естествен полизахарид, използван при производството на дермални филъри за естетически цели.Тъй като има период на полуразпад от няколко дни в човешките тъкани, дермалните пълнители на базата на НА са химически модифицирани, за да удължат живота си в тялото.Най-честата модификация в търговските пълнители на базата на НА е използването на 1,4-бутандиол диглицидил етер (BDDE) като омрежващ агент за омрежване на веригите на НА.Остатъчен или нереагирал BDDE се счита за нетоксичен при <2 части на милион (ppm);следователно, остатъчният BDDE в крайния дермален пълнител трябва да бъде количествено определен, за да се гарантира безопасността на пациента.Материали и методи: Това изследване описва откриването и характеризирането на страничен продукт от реакцията на омрежване между BDDE и HA при алкални условия чрез комбиниране на течна хроматография и масспектрометрия (LC-MS).Резултати: След различни анализи беше установено, че алкалните условия и високата температура, използвани за дезинфекция на HA-BDDE хидрогела, насърчават образуването на този нов страничен продукт, "подобното на пропилен гликол" съединение.LC-MS анализът потвърди, че страничният продукт има същата моноизотопна маса като BDDE, различно време на задържане (tR) и различен режим на UV абсорбция (λ=200 nm).За разлика от BDDE, беше наблюдавано при LC-MS анализ, че при същите условия на измерване този страничен продукт има по-висока степен на откриване при 200 nm.Заключение: Тези резултати показват, че няма епоксид в структурата на това ново съединение.Дискусията е отворена за оценка на риска от този нов страничен продукт, открит при производството на HA-BDDE хидрогел (HA дермален пълнител) за търговски цели.Ключови думи: хиалуронова киселина, HA дермален филър, омрежена хиалуронова киселина, BDDE, LC-MS анализ, BDDE страничен продукт.
Филърите на базата на хиалуронова киселина (ХК) са най-разпространените и популярни дермални филъри, използвани за козметични цели.1 Този дермален пълнител е хидрогел, обикновено съставен от >95% вода и 0,5-3% НА, което им придава гелообразна структура.2 НА е полизахарид и основният компонент на извънклетъчния матрикс на гръбначните животни.Една от съставките.Състои се от (1,4)-глюкуронова киселина-β (1,3)-N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) повтарящи се дизахаридни единици, свързани с гликозидни връзки.Този модел на дизахариди е еднакъв във всички организми.В сравнение с някои базирани на протеини пълнители (като колаген), това свойство прави ХК изключително биосъвместима молекула.Тези пълнители могат да проявят специфичност на аминокиселинната последователност, която може да бъде разпозната от имунната система на пациента.
Когато се използва като дермален пълнител, основното ограничение на НА е бързият й оборот в тъканите поради наличието на специфично семейство ензими, наречени хиалуронидази.Досега са описани няколко химически модификации в структурата на НА за увеличаване на полуживота на НА в тъканите.3 Повечето от тези модификации се опитват да намалят достъпа на хиалуронидазата до полизахаридните полимери чрез омрежване на HA вериги.Следователно, поради образуването на мостове и междумолекулните ковалентни връзки между структурата на НА и омрежващия агент, омреженият хидрогел НА произвежда повече продукти на антиензимно разграждане, отколкото естествената НА.4-6
Досега химическите омрежващи агенти, използвани за производството на омрежена НА, включват метакриламид, 7 хидразид, 8 карбодиимид, 9 дивинил сулфон, 1,4-бутандиол диглицидил етер (BDDE) и поли(етилен гликол) диглицидил етер.10,11 BDDE в момента е най-често използваният омрежващ агент.Въпреки че тези видове хидрогелове са доказани като безопасни от десетилетия, използваните омрежващи агенти са реактивни реагенти, които могат да бъдат цитотоксични и в някои случаи мутагенни.12 Следователно тяхното остатъчно съдържание в крайния хидрогел трябва да е високо.BDDE се счита за безопасен, когато остатъчната концентрация е по-малка от 2 части на милион (ppm).4
Има няколко метода за откриване на концентрация на ниско остатъчен BDDE, степен на омрежване и позиция на заместване в НА хидрогелове, като газова хроматография, хроматография с изключване на размера, съчетана с масова спектрометрия (MS), методи за измерване на флуоресценция с ядрено-магнитен резонанс (NMR) и Високоефективна течна хроматография (HPLC), свързана с диодна матрица.13-17 Това изследване описва откриването и характеризирането на страничен продукт в крайния омрежен HA хидрогел, произведен от реакцията на BDDE и HA при алкални условия.HPLC и течна хроматография-мас спектрометрия (LC-MS анализ).Тъй като токсичността на този страничен продукт на BDDE е неизвестна, ние препоръчваме количественото определяне на остатъчните му количества да се определи по начин, подобен на метода, който обикновено се извършва с BDDE в крайния продукт.
Получената натриева сол на НА (Shiseido Co., Ltd., Токио, Япония) има молекулно тегло ~1,368,000 Da (метод на Лоран) 18 и присъщ вискозитет от 2,20 m3/kg.За реакцията на омрежване, BDDE (≥95%) е закупен от Sigma-Aldrich Co. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).Фосфатно буфериран физиологичен разтвор с рН 7.4 беше закупен от Sigma-Aldrich Company.Всички разтворители, ацетонитрил и вода, използвани в LC-MS анализа, са закупени от качество HPLC.Мравчена киселина (98%) се закупува като реагент.
Всички експерименти бяха извършени на система UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, USA) и свързани с API 3000 троен квадруполен масспектрометър, оборудван с източник на йонизация с електроспрей (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Синтезът на омрежени HA хидрогелове започва чрез добавяне на 198 mg BDDE към 10% (w/w) разтвор на натриев хиалуронат (NaHA) в присъствието на 1% алкали (натриев хидроксид, NaOH).Крайната концентрация на BDDE в реакционната смес е 9,9 mg/mL (0,049 mM).След това реакционната смес се разбърква старателно и се хомогенизира и се оставя да действа при 45°С в продължение на 4 часа.19 рН на реакцията се поддържа при ~12.
След това реакционната смес се промива с вода и крайният HA-BDDE хидрогел се филтрува и разрежда с PBS буфер, за да се постигне концентрация на НА от 10 до 25 mg/mL и крайно рН от 7,4.За да се стерилизират произведените омрежени НА хидрогелове, всички тези хидрогелове се обработват в автоклав (120°C за 20 минути).Пречистеният BDDE-HA хидрогел се съхранява при 4°C до анализа.
За да се анализира BDDE, присъстващ в омрежения HA продукт, проба от 240 mg беше претеглена и въведена в централния отвор (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, САЩ; обем 0,5 mL) и центрофугирана при 10 000 rpm при стайна температура 10 минути.Общо 20 µL изтеглена течност беше събрана и анализирана.
За да се анализира стандартът BDDE (Sigma-Aldrich Co) при алкални условия (1%, 0,1% и 0,01% NaOH), ако са изпълнени следните условия, течната проба е 1:10, 1:100 или до 1:1 000 000 Ако е необходимо, използвайте MilliQ дейонизирана вода за анализ.
За изходните материали, използвани в реакцията на омрежване (HA 2%, H2O, 1% NaOH и 0,049 mM BDDE), 1 mL от всяка проба, приготвена от тези материали, се анализира при използване на същите условия за анализ.
За да се определи специфичността на пиковете, появяващи се в йонната карта, 10 µL от 100 ppb BDDE стандартен разтвор (Sigma-Aldrich Co) се добавят към 20 µL проба.В този случай крайната концентрация на стандарта във всяка проба е 37 ppb.
Първо, пригответе изходен разтвор на BDDE с концентрация от 11 000 mg/L (11 000 ppm) чрез разреждане на 10 μL стандартен BDDE (Sigma-Aldrich Co) с 990 μL MilliQ вода (плътност 1,1 g/mL).Използвайте този разтвор, за да приготвите 110 µg/L (110 ppb) разтвор на BDDE като междинно стандартно разреждане.След това използвайте междинния стандартен разредител BDDE (110 ppb), за да подготвите стандартната крива, като разреждате междинния разредител няколко пъти, за да постигнете желаната концентрация от 75, 50, 25, 10 и 1 ppb.Както е показано на фигура 1, установено е, че стандартната крива на BDDE от 1,1 до 110 ppb има добра линейност (R2>0,99).Стандартната крива се повтаря в четири независими експеримента.
Фигура 1 BDDE стандартна калибровъчна крива, получена чрез LC-MS анализ, в която се наблюдава добра корелация (R2>0,99).
Съкращения: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия.
За идентифициране и количествено определяне на BDDE стандартите, присъстващи в омрежената НА и BDDE стандартите в основния разтвор, беше използван LC-MS анализ.
Хроматографското разделяне се постига на LUNA 2.5 µm C18(2)-HST колона (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, СА, САЩ) и се поддържа при стайна температура (25°C) по време на анализа.Подвижната фаза се състои от ацетонитрил (разтворител А) и вода (разтворител В), съдържащи 0,1% мравчена киселина.Подвижната фаза се елуира чрез градиентно елуиране.Градиентът е както следва: 0 минути, 2% A;1 минута, 2% A;6 минути, 98% А;7 минути, 98% А;7.1 минути, 2% А;10 минути, 2% A. Времето за работа е 10 минути и инжекционният обем е 20 µL.Времето на задържане на BDDE е около 3,48 минути (вариращи от 3,43 до 4,14 минути въз основа на експерименти).Подвижната фаза се изпомпва при скорост на потока от 0.25 mL/min за LC-MS анализ.
За анализ на BDDE и количествено определяне чрез MS, системата UPLC (Waters) се комбинира с API 3000 троен квадруполен масспектрометър (AB SCIEX), оборудван с източник на йонизация с електроспрей, и анализът се извършва в режим на положителни йони (ESI+).
Съгласно анализа на йонния фрагмент, извършен върху BDDE, фрагментът с най-висок интензитет е определен като фрагментът, съответстващ на 129,1 Da (Фигура 6).Следователно, в режима на многойонно наблюдение (MIM) за количествено определяне, преобразуването на масата (съотношение маса към заряд [m/z]) на BDDE е 203,3/129,1 Da.Той също така използва режим на пълно сканиране (FS) и режим на сканиране на продуктови йони (PIS) за LC-MS анализ.
За да се провери специфичността на метода, беше анализирана празна проба (начална подвижна фаза).Не беше открит сигнал в празната проба с масово преобразуване от 203,3/129,1 Da.По отношение на повторяемостта на експеримента бяха анализирани 10 стандартни инжекции от 55 ppb (в средата на кривата на калибриране), което доведе до остатъчно стандартно отклонение (RSD) <5% (данните не са показани).
Остатъчното съдържание на BDDE беше количествено определено в осем различни автоклавирани BDDE омрежени HA хидрогелове, съответстващи на четири независими експеримента.Както е описано в раздела „Материали и методи“, количественото определяне се оценява чрез средната стойност на регресионната крива на стандартното разреждане на BDDE, което съответства на уникалния пик, открит при масовия преход на BDDE от 203,3/129,1 Da, със задържане време от 3.43 до 4.14 минути Без изчакване.Фигура 2 показва примерна хроматограма на 10 ppb BDDE референтен стандарт.Таблица 1 обобщава остатъчното съдържание на BDDE в осем различни хидрогела.Диапазонът на стойността е от 1 до 2,46 ppb.Следователно остатъчната концентрация на BDDE в пробата е приемлива за човешка употреба (<2 ppm).
Фигура 2 Йонна хроматограма на 10 ppb BDDE референтен стандарт (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) преход, получен чрез LC-MS анализ на 203.30/129.10 Da (в положителен MRM режим).
Съкращения: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия;MRM, мониторинг на множество реакции;MS, маса;m/z, съотношение маса-заряд.
Забележка: Проби 1-8 са автоклавирани BDDE омрежени HA хидрогелове.Остатъчното количество BDDE в хидрогела и пикът на времето на задържане на BDDE също се отчитат.И накрая, също се съобщава за съществуването на нови пикове с различни времена на задържане.
Съкращения: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидил етер;НА, хиалуронова киселина;MRM, мониторинг на множество реакции;tR, време на задържане;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия;RRT, относително време на задържане.
Изненадващо, анализът на LC-MS йонна хроматограма показа, че въз основа на всички анализирани проби от автоклав омрежен НА хидрогел, има допълнителен пик при по-краткото време на задържане от 2,73 до 3,29 минути.Например, Фигура 3 показва йонната хроматограма на омрежена проба от НА, където допълнителен пик се появява при различно време на задържане от приблизително 2,71 минути.Установено е, че наблюдаваното относително време на задържане (RRT) между новонаблюдения пик и пика от BDDE е 0,79 (Таблица 1).Тъй като знаем, че новонаблюдаваният пик се задържа по-малко в колоната C18, използвана в LC-MS анализа, новият пик може да съответства на по-полярно съединение от BDDE.
Фигура 3 Йонна хроматограма на проба от омрежен НА хидрогел, получена чрез LC-MS (конверсия на маса MRM 203,3/129,0 Da).
Съкращения: НА, хиалуронова киселина;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия;MRM, мониторинг на множество реакции;RRT, относително време на задържане;tR, време на задържане.
За да се изключи възможността наблюдаваните нови пикове да са замърсители, първоначално присъстващи в използваните суровини, тези суровини също бяха анализирани, като се използва същият метод за анализ LC-MS.Анализираните изходни материали включват вода, 2% NaHA във вода, 1% NaOH във вода и BDDE при същата концентрация, използвана в реакцията на омрежване.Йонната хроматограма на използвания изходен материал не показва никакво съединение или пик и времето му на задържане съответства на новия наблюдаван пик.Този факт отхвърля идеята, че не само изходният материал може да съдържа съединения или вещества, които могат да попречат на процедурата за анализ, но няма никакви признаци за възможно кръстосано замърсяване с други лабораторни продукти.Стойностите на концентрацията, получени след LC-MS анализ на BDDE и новите пикове са показани в таблица 2 (проби 1-4) и йонната хроматограма на фигура 4.
Забележка: Проби 1-4 съответстват на суровините, използвани за производството на автоклавирани BDDE омрежени HA хидрогелове.Тези проби не са автоклавирани.
Съкращения: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидил етер;НА, хиалуронова киселина;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия;MRM, мониторинг на множество реакции.
Фигура 4 съответства на LC-MS хроматограма на проба от суровината, използвана в реакцията на омрежване на HA и BDDE.
Забележка: Всички те се измерват при една и съща концентрация и съотношение, използвани за провеждане на реакцията на омрежване.Числата за суровините, анализирани чрез хроматограмата, съответстват на: (1) вода, (2) 2% воден разтвор на НА, (3) 1% воден разтвор на NaOH.LC-MS анализ се извършва за преобразуване на маса от 203.30/129.10 Da (в положителен MRM режим).
Съкращения: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидил етер;НА, хиалуронова киселина;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия;MRM, мониторинг на множество реакции.
Изследвани са условията, довели до образуването на нови пикове.За да се проучи как реакционните условия, използвани за получаване на омрежения HA хидрогел, влияят върху реактивността на BDDE омрежващия агент, което води до образуването на нови пикове (възможни странични продукти), бяха извършени различни измервания.При тези определяния ние изследвахме и анализирахме крайния BDDE омрежител, който беше обработен с различни концентрации на NaOH (0%, 1%, 0,1% и 0,01%) във водна среда, последвано от или без автоклавиране.Бактериалната процедура за симулиране на същите условия е същата като метода, използван за получаване на омрежения НА хидрогел.Както е описано в раздела "Материали и методи", масовият преход на пробата се анализира чрез LC-MS до 203.30/129.10 Da.BDDE и концентрацията на новия пик се изчисляват и резултатите са показани в таблица 3. Не са открити нови пикове в пробите, които не са автоклавирани, независимо от наличието на NaOH в разтвора (проби 1-4, таблица 3).За автоклавирани проби нови пикове се откриват само в присъствието на NaOH в разтвора и образуването на пика изглежда зависи от концентрацията на NaOH в разтвора (проби 5-8, таблица 3) (RRT = 0,79).Фигура 5 показва пример на йонна хроматограма, показваща две автоклавирани проби в присъствието или отсъствието на NAOH.
Съкращения: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия;MRM, мониторинг на множество реакции.
Забележка: Горната хроматограма: Пробата се третира с 0,1% воден разтвор на NaOH и се автоклавира (120°C за 20 минути).Долна хроматограма: Пробата не е третирана с NaOH, а е автоклавирана при същите условия.Масовото превръщане на 203.30/129.10 Da (в положителен MRM режим) се анализира чрез LC-MS.
Съкращения: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия;MRM, мониторинг на множество реакции.
Във всички автоклавирани проби, със или без NaOH, концентрацията на BDDE беше силно намалена (до 16,6 пъти) (проби 5-8, Таблица 2).Намаляването на концентрацията на BDDE може да се дължи на факта, че при високи температури водата може да действа като основа (нуклеофил), за да отвори епоксидния пръстен на BDDE, за да образува 1,2-диолно съединение.Моноизотопното качество на това съединение е различно от това на BDDE и следователно няма да бъде засегнато.LC-MS открива промяна на масата от 203.30/129.10 Da.
И накрая, тези експерименти показват, че генерирането на нови пикове зависи от наличието на BDDE, NAOH и процеса на автоклавиране, но няма нищо общо с НА.
Новият пик, открит при време на задържане от приблизително 2.71 минути, след това се характеризира с LC-MS.За тази цел BDDE (9,9 mg/mL) се инкубира в 1% воден разтвор на NaOH и се автоклавира.В таблица 4 характеристиките на новия пик са сравнени с известния референтен пик на BDDE (време на задържане приблизително 3,47 минути).Въз основа на анализа на йонната фрагментация на двата пика може да се заключи, че пикът с време на задържане от 2,72 минути показва същите фрагменти като пика на BDDE, но с различен интензитет (Фигура 6).За пика, съответстващ на времето на задържане (PIS) от 2,72 минути, се наблюдава по-интензивен пик след фрагментиране при маса от 147 Da.При концентрацията на BDDE (9,9 mg/mL), използвана при това определяне, също се наблюдават различни режими на абсорбция (UV, λ=200 nm) в ултравиолетовия спектър след хроматографско разделяне (Фигура 7).Пикът с време на задържане от 2,71 минути все още се вижда при 200 nm, докато пикът на BDDE не може да се наблюдава в хроматограмата при същите условия.
Таблица 4 Резултати от характеризиране на новия пик с време на задържане от около 2,71 минути и пика на BDDE с време на задържане от 3,47 минути
Забележка: За да се получат тези резултати, LC-MS и HPLC анализи (MRM и PIS) бяха извършени на двата пика.За HPLC анализ се използва UV детекция с дължина на вълната 200 nm.
Съкращения: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидил етер;HPLC, високоефективна течна хроматография;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия;MRM, мониторинг на множество реакции;m/z, съотношение маса-заряд;PIS, продуктово йонно сканиране;ултравиолетова светлина, ултравиолетова светлина.
Забележка: Масовите фрагменти са получени чрез LC-MS анализ (PIS).Горна хроматограма: мас спектър на BDDE стандартни фрагменти от проба.Долна хроматограма: Масовият спектър на открития нов пик (RRT, свързан с пика на BDDE, е 0,79).BDDE се обработва в 1% разтвор на NaOH и се автоклавира.
Съкращения: BDDE, 1,4-бутандиол диглицидил етер;LC-MS, течна хроматография и масспектрометрия;MRM, мониторинг на множество реакции;PIS, продуктово йонно сканиране;RRT, относително време на задържане.
Фигура 7 Йонна хроматограма на 203,30 Da прекурсорен йон и (A) новият пик с време на задържане от 2,71 минути и (B) UV откриването на пика на референтния стандарт на BDDE при 3,46 минути при 200 nm.
Във всички получени омрежени HA хидрогелове се наблюдава, че остатъчната концентрация на BDDE след количествено определяне LC-MS е <2 ppm, но в анализа се появява нов неизвестен пик.Този нов пик не отговаря на стандартния продукт BDDE.Стандартният продукт BDDE също е преминал анализ на същото преобразуване на качеството (преобразуване на MRM 203,30/129,10 Da) в положителен режим на MRM.Като цяло други аналитични методи като хроматография се използват като гранични тестове за откриване на BDDE в хидрогелове, но максималната граница на откриване (LOD) е малко по-ниска от 2 ppm.От друга страна, досега NMR и MS са използвани за характеризиране на степента на омрежване и/или модификация на НА във фрагментите на захарната единица на омрежени HA продукти.Целта на тези техники никога не е била да се определи количествено остатъчното откриване на BDDE при толкова ниски концентрации, както описваме в тази статия (LOD на нашия LC-MS метод = 10 ppb).
Време на публикуване: 01 септември 2021 г